ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA

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ISSN 0582-9879 ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(7): 624–628 CN 31-1300/Q

Biological Function of Fusion Protein ATF-PAI2CD

WANG Xia, LI Ping, ZHANG Yu-Qing, HOU Min, SUN Xing-Hui, TAN Li, ZHU Yun-Song*
( Department of Molecular Genetics, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China )

Abstract To express the fusion protein ATF-PAI2CD (urokinase-type plasminogen activator amino terminal fragment-plasminogen activator inhibitor type 2 with the region inter C and D helices deleted ) gene in E.coli and determine the biological characterization of fusion protein ATF-PAI2CD, the cDNA fragment encoding ATF-PAI2CD was cloned into the expression vector pLY-4 and transformed into E.coli JF1125. After temperature induction, the expression amount of ATF-PAI2CD account for 15% of total bacterial protein. The result was confirmed by Western blot. ATF-PAI2CD protein was isolated and purified by washing and solubilization of inclusion body, renaturation and ion exchange chromatography. The final product displayed a single band with a corresponding molecular weight 62 kD in SDS-PAGE. The purity was over 90%, the protein yield was 50% and the specific activity was 12 000 IU/mg. The PAI activity was measured by chromogenic assay. The purified fusion protein inhibited urokinase-type plasminogen activator as measured by milk-agarose plate assay, and bound to human lung cancer cells via uPA receptor (uPAR), which was confirmed by radio competition experiments. The results indicate that the biological characteristics of ATF-PAI2CD were very similar to those of the wide type PAI-2 (or mutants PAI-2, PAI-2CD) and to pro-uPA in binding to uPAR-bearing cells.

Key words fusion protein; expression; purification; radio ligand receptor binding assay

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Received: February 24, 2003 Accepted: April 9, 2003

This work was supported by a grant from the the National Natural Science Foundation of China (No.30170398)

*Corresponding author: Tel, 86-21-54237278; Fax, 86-21-64033738; e-mail, [email protected]

ATF-PAI2CD融合蛋白的生物学功能

王霞李平张宇清侯敏孙兴会谭理朱运松*

( 复旦大学上海医学院分子遗传教研室, 上海 200032 )

摘要为了解尿激酶型纤溶酶激活物(urokinase-type plaminogen activator, uPA)的氨基末端片段(amino-terminal fragment, ATF)和纤溶酶激活物抑制剂2(plasminogen activator inhibitor type-2, PAI-2)突变体PAI-2CD融合蛋白在大肠杆菌的表达情况及进一步研究其生物学活性、将ATF-PAI2CD融合基因与大肠杆菌表达载体pLY-4重组得到表达质粒pZWE-ATF-PAI2CD，以其转化大肠杆菌JF1125，经温度诱导， ATF-PAI2CD获得较高水平表达，融合蛋白质以包涵体形式存在，占菌体总蛋白质的15%。包涵体经洗涤、8 mol/L尿素溶解、稀释复性及离子交换色谱一步分离，纯度达90%，分子量与理论值相符。每升发酵液得重组融合蛋白质50 mg。经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性，比活性达12 000 IU/mg；应用放射竞争法证实融合蛋白质能与肿瘤细胞表面的uPA受体特异性结合。双功能融合蛋白质的纤溶抑制活性与野生型PAI-2(或PAI-2突变体， PAI-2CD)基本一致，与肿瘤细胞表面的uPA受体的结合能力同pro-uPA。

关键词 融合蛋白质；表达；纯化；放射竞争抑制实验

尿激酶型纤溶酶激活物(urokinase-type plami-nogen activator, uPA)及其受体(urokinase-type plaminogen activator receptor, uPAR)在黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤侵袭转移中起着重要作用[1]。 uPA/uPAR系统参与了肿瘤演进、血管生成和转移。该系统包括uPA、uPAR及其纤溶酶激活物抑制剂1和2(plasminogen activator inhibitor type-1和type-2， PAI-1和PAI-2)。 uPA、uPAR及PAI-1的高表达，促进了疾病的演进，导致病人预后不良。 uPA、uPAR的表达多位于肿瘤细胞侵袭前缘。与uPA、uPAR、 PAI-1不同， PAI-2在多数肿瘤侵袭转移时表达水平低[2]。在细胞外， PAI-2通过抑制uPA的活性而抑制内皮细胞血管生成及阻遏肿瘤细胞侵袭转移，而在细胞内PAI-2则具有另外的功能。我们先前的研究发现，在细胞内PAI-2能够抵抗TNF-α诱导的细胞凋亡，这种抵抗作用依赖于其C、D螺旋间区(66～98位氨基酸)[3,4]。缺失C、D螺旋间区33个氨基酸残基的突变体PAI-2CD不再具有抵抗TNF-α诱导的细胞凋亡，而其纤溶抑制活性未受影响[3]。

uPA是由氨基末端片段(amino-terminal fragment， ATF，包括1～47位氨基酸的生长因子结构域、48～134位氨基酸的Kringle结构域)和丝氨酸蛋白酶结构域组成。 uPA通过其生长因子结构域与uPAR结合。当uPA与uPAR结合后，多条通路被激活，从而发挥其在肿瘤演进中的多种功能[5]，包括活化细胞内的多种信号转导通路和uPA介导的细胞外基质及基底膜的降解，使得肿瘤细胞能够穿过基底膜进入血管，而产生转移。由于uPA/uPAR系统与多种恶性肿瘤的转移高度相关，不仅其表达水平成为这些恶性肿瘤的预后标志，且该系统也成为恶性肿瘤治疗的新靶标[6,7]。

我们利用基因工程手段把uPA的ATF与PAI-2CD通过11个柔性较强的氨基酸残基连接，在大肠杆菌中表达出了既能与uPA竞争结合细胞表面的uPAR，又能直接抑制uPA丝氨酸蛋白酶活性的双功能蛋白质，并对其生物学功能进行了研究，为进一步探索抗肿瘤治疗提供了新途径。

1 材料和方法(Materials and Methods)

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 大肠杆菌DH5α、pGEM3Zf(+)质粒、95D细胞株为本实验室冻存； pLY-4质粒和JF1125宿主菌由中科院生化细胞所刘新垣教授惠赠； pUKLTR6质粒由以色列RUTH教授惠赠； pZT-PAI2CD质粒由本室构建[3]。

1.1.2 试剂和仪器 限制性内切酶、 RPMI 1640购自Gibco BRL公司； Qiagen plasmid Mini/Midi kit购自Qiagen公司； Q-Sepharose　FF购自Pharmacia公司；兔抗PAI-2抗血清、鼠抗uPA抗血清由本室自制，羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP、 FITC标记的羊抗兔IgG-HRP、 FITC-标记的羊抗鼠IgG-HRP购自华美生物工程公司。

1.1.3 引物设计和合成 用于扩增uPA的ATF的引物为： P1， 5′-GAG GAA TTC ATG AGC AAC GAA CTT CAC CAA-3′，引入EcoRI位点和ATG； P2， 5′-GAA GGT ACC ACC AGA ACC ACC ACC TCC ATC TGC GCA GTC-3′，引入GGGSG五个氨基酸残基及KpnI位点，以pUKLTR6为模板。用于扩增PAI-2CD的引物为： P3， 5′-AAG GTA CCG GTG GTT CCG GTG AGG ATC TTT GTG TG-3′，引入KpnI位点和GGSG四个氨基酸残基； P4， 5′-GGG GAT CCT TAG GGT GAG GAA AAT CT-3′，引入BamHI位点和终止密码子TAA，以pZT-PAI2CD 为模板。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分子生物学操作 分子克隆基本操作技术参照文献[8]的方法。核苷酸序列分析由上海基因生物工程公司合成。

1.2.2 融合蛋白质 ATF-PAI2CD在大肠杆菌表达系统中的表达将pZWE-ATF-PAI2CD转化大肠杆菌JF1125，筛选高表达菌株。经M9CA培养液30 °C培养， 42 °C温度诱导表达，离心收集菌体。诱导前后细菌裂解液进行SDS-PAGE分析。

1.2.3 包涵体的分离、溶解与复性 湿菌用0.05 mol/L PB缓冲液悬浮，以高压匀浆泵压榨，离心后， SDS-PAGE分析目的蛋白质的存在状态。压榨离心所得沉淀经洗涤离心后，以0.1 mol/L PB、8 mol/L尿素、0.5%巯基乙醇溶解，室温作用1 h，至澄清透明。超离心后弃沉淀，取上清液稀释复性。

1.2.4 Q-Sepharose FF柱层析以10倍柱体积0.05 mol/L PB缓冲液平衡色谱柱，稀释复性后溶液直接上柱， Waters色谱仪控制流速和检测蛋白质峰。上样结束后，以0.05 mol/L PB缓冲液洗至基线， 0～1 mol/L NaCl梯度洗脱，收集洗脱组分， 10% SDS-PAGE分析目的蛋白质分布，并以Bradford法测定蛋白质浓度。

1.2.5 重组融合蛋白质的生物学功能 (1) 溶圈抑制法参照文献[9]的方法定性检测样品PAI活性。牛奶板含10 g/L琼脂糖、 10 g/L脱脂牛奶、 5 mg/L人纤溶酶原、 0.5 IU/ml尿激酶。 (2) 发色底物法参照文献[10]的方法测定样品的比活性。 PAI活性单位定义为： 25 °C时， 20 min内抑制1.0国际单位尿激酶的PAI量，为1.0 IU。

1.2.6 放射竞争抑制实验[11] 用I125标记融合蛋白、pro-uPA，纯化后放射性比活分别为1～2 Ci/g、1～4 Ci/g 。用100倍未标记I125的样品检测其非特异性结合。

2 结果(Results)

2.1 重组表达质粒

用分子生物学常规方法[8]克隆出融合蛋白质基因，并插入原核表达质粒pLY4的EcoRI和BamHI酶切位点之间，构成建重组表达质粒pZWE-ATF-PAI2CD(图1)。

Fig.1 The recombinant expression plasmid pZWE-ATF-PAI2CD

The fusion protein gene including ATF,　linker,　and　PAI2CD was cloned into vector pLY4 containing promoter PRPL, and the recombinant expression plasmid was named pZWE-ATF-PAI2CD.

2.2 重组融合蛋白质在大肠杆菌中的表达及鉴定

质粒pZWE-ATF-PAI2CD转化大肠杆菌JF1125，经温度诱导表达后， SDS-PAGE分析表达产物。从图2(A)中可见诱导后细菌裂解液在分子量62 kD处有一浓集条带，与融合蛋白质的理论分子量相符。菌体经压榨离心后， 62 kD条带主要位于沉淀中，表明表达产物是以包涵体形式存在。

Western印迹结果显示，融合蛋白质在分子量约62 kD处出现了一条特异性条带(图3)，说明融合蛋白质具有PAI-2和uPA的抗原性。

Fig.2 SDS-PAGE analysis of pZWE-ATF-PAI2CD expressed in E.coli JF1125 and purified fusion protein

(A) 10%SDS-PAGE analysis of pZWE-ATF-PAI2CD expressed in E.coli JF1125. 1， inclusion bodies； 2， bacteria supernatant； 3， protein marker； 4， total protein of pZWE-ATF-PAI2CD/JF1125 after temperature indution； 5， total protein of pZWE-ATF-PAI2CD/JF1125 before temperature induction. (B) 10%SDS-PAGE analysis of 5 μg purified fusion protein. 1,　purified fusion protein;　2, protein marker.

Fig.3 Western blotting analysis of the fusion protein

(A) uPA polyclonal antibody; (B) PAI-2 polyclonal antibody.

2.3 融合蛋白质包涵体的体外变复性及分离纯化

以1 L表达菌的菌液为原料，尿素变性后，上清液进行稀释复性处理，经离子交换层析纯化，发色底物法检测可获得总纤溶抑制活性约为600 000 IU的融合蛋白质，比活性达12 000 IU/mg。 CS-910扫描分析纯度可达90%，如图2(B)所示。溶圈抑制法测定纯化的融合蛋白质具有纤溶抑制活性，如图4所示。

2.4 重组融合蛋白质的细胞结合能力

为了鉴定融合蛋白质是否能与肿瘤细胞特异性结合，培养的95D细胞与1 nmol/L 125I标记的融合蛋白质ATF-PAI2CD温育的同时，分别加入不同浓度未标记125I的pro-uPA和PAI-2CD，洗涤细胞后，进行放射活性的测定。 PAI-2CD不影响融合蛋白质与95D细胞的结合；而随着pro-uPA浓度的增加，

Fig.4 Inhibitory effect of fusion protein on UK activity by milk-agarose plate assay

1, PAI-2CD (10 mg/ L)； 2, 3, 4, purified fusion protein (10, 50 and 50 mg/L)； 5, 0.05 mol/L PBS.

融合蛋白质与95D细胞的结合能力明显下降(如图5所示)。把125I标记的不同浓度的融合蛋白质和125I标记pro-uPA分别加入酸处理的95D细胞，通过放射竞争实验测定，利用Scatchard作图(图6，图7)分析融合蛋白质与95D细胞表面的uPAR的解离常数KD分别为(0.9±0.1)nmol/L， 95D细胞表面的uPAR结合位点的分子数分别为(86 000±6500)个／细胞， pro-uPA的解离常数KD为(1.1±0.2) nmol/L， 95 D细胞表面的uPAR结合位点的分子数为(78 000±4900)个／细胞， n=3。

Fig.5 Competiton binding of [125I]-ATF-PAI2CD to 95D lung cancer cells

Each point represents the x±s of results from three separate experiments, each with triplicate determinations. □, ATF-PAI2CD; ●, PAI-2CD; ▲, pro-uPA.

Fig.6 Scatchard analysis of [125I]-pro-uPA binding to 95D lung cancer cells

Specific binding of [125I]-pro-uPA was determined by subtracting the activity bound in the presence of a 100-fold excess of unlabeded pro-uPA from the total. Each point represents the x±s of results from three separate experiments, each with triplicate determinations.

Fig.7 Scatchard analysis of [125I]-ATF-PAI2CD binding to 95D lung cancer cells

Specific binding of [125I]-ATF-PAI2CD was determined by subtracting the activity bound in the presence of a 100-fold excess of unlabeded ATF-PAI2CD from the total. Each point represents the x±s of results from three separate experiments, each with triplicate determinations.

3 讨论(Discusion)

由于肿瘤细胞及与肿瘤侵袭转移有关的细胞，如巨噬细胞和血管内皮细胞等高表达uPAR，所以，为了更有效的靶向这些细胞，我们构建了双功能融合蛋白质ATF-PAI2CD的基因并在大肠杆菌进行表达。

我们曾用酵母表达系统表达融合蛋白质，但表达量较低，经多步纯化后，每升发酵液仅能得到1毫克的纯蛋白质，这为下一步的研究带来了困难。鉴于此，我们采用大肠杆菌表达系统尝试融合蛋白质ATF-PAI2CD的表达。利用大肠杆菌表达外源蛋白质时，表达产物往往形成不溶的无活性的包涵体[12]。形成包涵体的主要原因之一是胞质内高还原环境使蛋白质二硫键稳定下降，出现错配的二硫键。融合蛋白质中有7对二硫键，二硫键的随机配对的几率很高，其结果是表达产物以包涵体的形式存在。

融合蛋白质包涵体经变复性后，发色底物法证实与野生型PAI-2有相似的纤溶抑制活性[13,14]；放射竞争抑制实验结果表明融合蛋白质与pro-uPA具有相同的结合肿瘤细胞表面uPAR的能力，且融合蛋白质与肿瘤细胞表面uPAR的结合具有量效关系,说明融合蛋白质是通过其ATF与肿瘤细胞表面的uPAR结合的；通过受体竞争实验融合蛋白质与95D细胞的KD为(0.9±0.1) nmol/L， pro-uPA 与95D细胞表面uPAR的KD为(1.1±0.2)nmol/L，与文献报道乳腺癌细胞株MDA-MB-231及髓样白血病细胞株U937的KD相似[15～17]，进一步表明融合蛋白质的ATF能够特异性结合肿瘤细胞表面的uPAR， 95D细胞表面的uPAR结合位点的分子数较多，为利用95D肺癌细胞进行肿瘤靶向治疗提供了实验依据。

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